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[摘要] 目的 探讨白藜芦醇（Res）对小鼠宫颈癌细胞株U14移植瘤的抑制作用及其相关机制。 方法 构建615近交系小鼠U14移植瘤动物模型，并随机分为对照组、Res组、顺铂组，每组10只，给予相应药物干预，接种后第26天处死全部小鼠，检测肿瘤体积及重量，计算抑瘤率，通过免疫组织化学染色法检测肿瘤组织微血管密度（MVD），采用荧光实时定量PCR和Western blotting分析肿瘤组织缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA及蛋白表达水平。 结果 Res组和顺铂组抑瘤率分别为50.46%、57.19%；Res组和顺铂组肿瘤体积、肿瘤质量较对照组显著降低（P<0.01）；与对照组比较，Res组和顺铂组HIF-1α、VEGF mRNA与蛋白表达水平及MVD明显降低，差异有统计学意义（P<0.01），但Res组与顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 Res通过下调HIF-1α、VEGF表达抑制小鼠宫颈癌的生长。
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[关键词] 白藜芦醇；宫颈癌；缺氧诱导因子-1α；血管内皮生长因子
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）11（a）-0007-03
Effect of resveratrol on cervix cancer growth and the expression of HIF-1α and VEGF in mice
TAN Chen HU Ke-ke DENG He-nan ZHANG Qin
Department of Gynecology，the First People′s Hospital Ceneral Hospital of Chenzhou City in Hunan Province，Chenzhou 423000，China
[Abstract] Objective To explore the inhibitory effect of resveratrol （Res） on transplanted cervix cancer cell U14 in mice，and its related molecular mechanisms.Methods The 615-strain mice with U14 cervical cancer cells were divided into three groups randomly，namely control group （n=10），Res group （n=10） and cisplatin group （n=10）.After drug intervention，all mice were sacrificed on day 26 posttransplantation.The volumes and weighs of tumors were detected，and tumor inhibition rate was calculated.Microvessel density （MVD） was measured by immunohistochemistry.The levels of hypoxia inducible factor-1α （HIF-1α） as well as vascular endothelia growth factor （VEGF） mRNA and protein expression were measured by real-time quantitative PCR and Western blotting，respectively.Results The tumor inhibition rate was 50.46% and 57.19% in Res group and cisplatin group，respectively.The volumes and weights of tumor was markedly decreased in Res group and cisplatin group compared with control group （P<0.01）.The levels of HIF-1α as well as VEGF mRNA and protein expression and MVD was significantly lower in Res group than that in control group respectively （P<0.01）.However，there was no significant difference in above indicators between Res group and cisplatin group （P>0.05）.Conclusion Res may suppress the growth of cervix cancer by downregulating the expression of HIF-1α and VEGF in mice.
[Key words] Resveratrol；Cervix cancer；Hypoxia inducible factor-1α；Vascular endothelia growth factor
宫颈癌是女性常见恶性肿瘤，近年来发病率升高，并呈年轻化趋势，严重危害生命健康。尽管宫颈癌的发病机制尚未完全阐明，但认为缺氧环境下血管生成在其中起重要作用[1]。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是一个能在缺氧状态下仍具有转录活性的因子，可上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而促进肿瘤血管生成和肿瘤生长。已有研究证实，HIF-1α、VEGF在宫颈癌组织中的表达水平显著增高，并与宫颈癌的侵袭能力密切相关[2]。化疗是宫颈癌常用的治疗措施，但常用的化疗药物毒副作用较大，限制了其临床应用，因此，从植物中分离抗肿瘤药物已成目前研究的热点。白藜芦醇（Res）属于非黄酮多酚类化合物，在葡萄、藜芦等植物中含量较丰富，对肝癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、喉癌、甲状腺癌等多种癌症产生抗癌效应[3]。研究发现，Res在体内、体外均对宫颈癌具有明显的抑制作用[4-5]。然而，Res的这种作用是否与其抑制HIF-1α、VEGF表达有关，仍不清楚。615近交系小鼠是复制宫颈癌较好的模型[6]。本实验通过复制该模型，研究Res对宫颈癌生长及HIF-1α、VEGF表达的影响，旨在为Res的临床应用提供实验依据。 1 材料与方法
1.1 药品与主要试剂
Res、顺铂分别由美国Sigma公司、江苏豪森药业股份有限公司提供。Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，Reverse Transcription System（ReverAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，#k1622）购于美国Promega公司，兔抗鼠HIF-1α、VEGF一抗为美国Santa Cruz公司产品，兔抗鼠CD34一抗购于福州迈新生物工程公司。
1.2 动物及肿瘤细胞株
615近交系小鼠购于中国科学院协和医科大学实验动物中心，SPF环境下饲养并适应1周后进入实验。由中国医学科学院肿瘤研究所提供的鼠宫颈癌U14瘤细胞株，复苏后即接种于615近交系小鼠的腹腔进行传代。
1.3 模型制备、分组给药
小鼠右侧背部皮下注射0.2 ml瘤细胞悬液（1×107个/只），当肿瘤直径>2.0 mm时即认为成瘤。在接种第6天，全部小鼠移植处均成瘤，称重后随机分为对照组（n=10）、Res组（n=10）、顺铂组（n=10，阳性对照）。Res组：依据预实验结果，实验中所使用的Res剂量为10 mg/kg，用0.1 ml 0.9%氯化钠溶液溶解后灌胃，每天1次，共20次；对照组：仅用等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，每天1次，共20次；顺铂组：将3 mg/kg顺铂溶解于0.9%氯化钠溶液0.1 ml中，腹腔注射，第6、12、18、24天每天注射1次，其余各日予0.1 ml 0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射。给药期间观察并记录小鼠的一般情况。第26天处死小鼠进行检测。
1.4 肿瘤体积、质量及抑瘤率
接种后每隔2 d称一次小鼠体重，并测量皮下移植瘤瘤最长径（a）、最短径（b），肿瘤体积（V）=a×b2/2。实验结束后处死全部小鼠，完整剥离肿瘤并称重，抑瘤率=（1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重）×100%。
1.5 HE染色
按常规进行HE染色，光镜下观察各组织病理改变。
1.6 免疫组织化学染色法
利用常规免疫组织化学SABC法测定癌组织中的微血管密度（MVD），按照文献方法判断MVD值[7]。
1.7 荧光实时定量PCR
通过Trizol试剂分离肿瘤组织中的总RNA，并溶于无Rnase水中，OD260/OD280在1.8～2.0，表明提取的RNA质量较好。取2 μg的总RNA，用购于Fermentas公司的逆转录试剂盒合成cDNA。HIF-1α引物序列，上游：5′-TCACGAGGGGTTCCCGCCTCGCA-3′，下游：5′-TGCGAGGCGGG-AAACCCCTCGTGA-3′，扩增产物长度为342 bp；VEGF引物序列，上游：5′-GGATCC ATGAACTTTCTGCT-3′，下游：5′-GAA TCC ACC GCC TCG GCT TGT C-3′，扩增产物长度为450 bp；内参照基因β-actin引物序列，上游：5′-CCAGCCTTCCTT-CTTGGGTAT-3′，下游：5′-TTGGCATAGAGGTCTTTA CGG-3′，扩增产物长度为102 bp。取10 μl产物进行PCR循环，94℃预变性3 min，94℃变性45 s，58℃复性30 s，在72℃时延伸45 s，总35个循环，最后72℃延伸10 min。用ΔΔCt值法，以β-actin表达作为内参定量HIF-1α、VEGF mRNA的表达值。
1.8 Western blotting
按常规方法进行Western blotting，通过Imager 2200软件检测各条带分光密度值，计算HIF-1α、VEGF蛋白表达量。HIF-1α或VEGF蛋白表达量=HIF-1α或VEGF积分光密度值/β-actin积分光密度值。
1.9 统计学处理
采用SPSS 13.0统计软件进行χ2检验、方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Res对移植瘤生长的抑制作用
在实验期间，顺铂组小鼠表现为精神差、活动少、食欲低及消瘦等，而Res组表现良好。治疗初期，对照组肿瘤生长速度相似，治疗5 d后，Res组和顺铂组肿瘤生长速度明显慢于对照组。实验结束后，Res组和顺铂组抑瘤率分别为50.46%、57.19%，两组比较，差异无统计学意义（P>0.05），与对照组比较，Res组、顺铂组肿瘤体积及质量明显降低（P<0.01），而Res组与顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。
表1 Res对移植瘤生长及MVD的影响（n=10）
与对照组比较，*P<0.01
2.2 Res对肿瘤组织病理学改变及新生血管形成的影响
HE染色显示，对照组呈现癌细胞的典型特点：癌细胞核大深染、增加的核浆比例、核异形性明显及病理性核分裂相，各用药组上述病变明显减轻（图1）。免疫组织化学染色显示，肿瘤组织切片中，内皮细胞呈棕黄色。统计学分析表明，与对照组比较，Res组和顺铂组MVD明显减少，差异有统计学意义（P<0.01），但Res组MVD与顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图2、表1）。
A B C
图1 各组肿瘤组织的病理学检查结果（HE×200）
A：对照组；B：Res组；C：顺铂组
A B C
图2 各组肿瘤组织的MVD（SABC×200）
A：对照组；B：Res组；C：顺铂组
2.3 Res对肿瘤组织HIF-1α、VEGF mRNA表达的影响 荧光实时定量PCR分析显示，对照组肿瘤组织HIF-1α、VEGF mRNA呈高水平表达，经Res或顺铂处理后，HIF-1α及VEGF mRNA表达量明显降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01），但Res组上述指标与顺铂组比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。
2.4 Res对肿瘤组织HIF-α、VEGF蛋白表达的影响
Res组和顺铂组HIF-1α、VEGF蛋白表达水平较对照组显著降低（P<0.01），但Res组与顺铂组上述指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）（图4）。
图4 各组肿瘤组织HIF-1α、VEGF 蛋白的表达
与对照组比较，*P<0.01
3 讨论
Res是一种重要的天然活性化合物，化学名称为反-3，5，4′-三羟基-1，2-二苯乙烯。随着国内外对Res抗肿瘤活性及其机制的深入探讨，近年认为Res是目前可与紫杉醇媲美的有前途的抗癌药物[8-10]。本研究发现，Res组抑瘤率接近于顺铂组，对照组相比，Res组和顺铂组肿瘤体积及质量明显降低，Res组上述指标与顺铂组比较，变化不明显，与本项目前期报道的结果一致[5]，进一步研究表明Res对宫颈癌移植瘤具有良好的抑制作用。此外，给予相应药物干预过程中，Res组小鼠的一般情况较好，而作为阳性对照的顺铂组小鼠出现活动减少、食欲下降、毛发干涩脱落、消瘦等一系列不良反应，提示本研究中Res的抑瘤效果与顺铂相当，但Res的不良作用更少。
新生血管形成在肿瘤的发展过程中扮演关键作用。MVD是目前反映肿瘤新生血管形成的最佳指标[11]。本实验研究结果显示，分析3组MVD值，发现对照组的MVD值处于最高水平，提示宫颈癌在其生长的过程中可能形成了非常丰富的新生血管，从而为其提供充足的血液和营养，以对抗肿瘤迅速生长所造成的局部缺氧，经Res干预治疗后，MVD显著降低，但与顺铂组比较差异无统计学意义，提示Res抗宫颈癌效应可能与其抑制肿瘤内血管形成有关。
由于肿瘤生长迅速，肿瘤中存在明显的缺氧区域，缺氧一方面可抑制肿瘤细胞分裂并导致其死亡，另一方面也能诱导各种基因的转录，使肿瘤细胞适应这一微环境，促进肿瘤细胞存活。HIF-1α即是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体的一种转录因子，可维持癌细胞的能量代谢以及促进癌细胞增殖、新生血管形成[12-13]。VEGF 是迄今发现的功能最强大的促血管生长因子，可特异性地诱导血管内皮细胞分裂、增殖与迁移，最终促进微血管形成，增加血管通透性，有利于肿瘤的生长与浸润[14]。有研究表明，HIF-1α通过诱导VEGF表达促进肿瘤新生血管的形成，两者在宫颈癌组织中呈高表达，并与宫颈癌病理分级、临床分期、淋巴转移密切相关[2，15]。本项目前期研究发现，MIF在宫颈癌组织中呈现高水平表达，且其表达水平与宫颈癌的临床分期、病理分化程度、淋巴结转移情况及肿瘤体积密切相关[8]。为了明确Res抑制宫颈癌生长及血管形成是否与其下调HIF-1α、VEGF表达有关，本文通过荧光实时定量PCR和Western blotting检测了各组HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达水平，结果表明，Res组HIF-1α、VEGF mRNA及蛋白表达量较对照组降低，但与顺铂组相比，无明显变化，提示Res体内抗宫颈癌作用可能与其下调HIF-1α、VEGF表达有关，然而Res下调HIF-1α、VEGF表达的机制不清楚，仍须进一步研究。
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（收稿日期2013-09-23 本文编辑：郭静娟）